重组腺病毒载体的原理与应用

腺病毒概述

腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒，其病毒颗粒直径约为60~90nm，呈现20面体的立体对称结构。腺病毒的衣壳由252个壳粒组成，这些壳粒排列形成240个六邻体（Hexon，每面12个）和12个五邻体（Penton）单位。五邻体位于顶端的角落，并且从每个顶角壳粒的基础伸出纤毛突起（Fiberprotruding），突起的末端具有一个结节区（Knob domain）。腺病毒基因组的长度约为36000bp，双端各有100~150bp的末端反向重复序列（Inverted terminal repeats, ITRs）。在左端ITRs 3'端有约300bp的包装信号（Ψ），是腺病毒复制和包装的必要顺式元件。根据DNA复制的顺序，腺病毒基因可分为与复制相关的早期基因E1~E4和与颗粒组装相关的晚期基因L1~L5。

腺病毒感染机制

当前用于基因治疗的主要是人类的2型和5型腺病毒，感染细胞的过程始于腺病毒纤毛的结节区对细胞表面与柯萨奇B病毒共用的柯萨奇/腺病毒受体（Coxsackie adenovirus receptor, CAR）的粘附。

重组腺病毒的包装系统

常用的腺病毒载体是基于Ad5改造成的复制缺陷型腺病毒载体（Adenoviral Vector，AdV），该载体通过去除腺病毒基因组中的E1和/或E3区域获得。E1基因是病毒复制的必需部分，其缺失导致病毒无法自主复制，从而需要在特定的293细胞中完成。E3基因则可以用作外源基因插入区，缺失E3能减少宿主的免疫反应。腺病毒包装系统主要分为两种：AdEasy™系统和AdMax系统。

南宫28的AdEasy™重组系统通过将克隆的外源基因转化至携带腺病毒大部分基因组的质粒中，利用细菌Cre重组酶进行重组，生成重组腺病毒载体基因组，从中筛选、扩增并提取质粒，最终在293细胞中包装成病毒颗粒。这种方法操作相对简单且同源重组率可达60%以上。而AdMax系统则通过分别构建含有外源基因的腺病毒质粒与插入Cre基因表达盒的包装质粒，共同转染293细胞，有助于高效表达Cre重组酶，产生更高效的重组腺病毒。

腺病毒载体的应用

腺病毒载体被广泛应用于体内外基因传递，能够在细胞或动物模型中选择性地过表达或沉默特定基因，为机制解析奠定基础。此外，腺病毒能够用于疾病模型构建，能够在小鼠肝脏中诱导特定基因突变，以模拟代谢性疾病。南宫28的Ad载体可被改造为复制缺陷型或选择性复制型的肿瘤病毒载体，特异性地感染和杀伤肿瘤细胞，成为基因治疗中最为常见的病毒载体之一。

南宫28的Ad载体还通过表达前体药物的转化酶以杀伤肿瘤，或通过递送表达免疫调节基因，激发相应的抗肿瘤免疫反应。此外，腺病毒可作为基因递送载体应用于疫苗研发，既能诱导体液免疫，也能激活细胞免疫，其载体本身更可发挥佐剂效应。基于南宫28的Ad载体当前在2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的临床试验中显示出良好应用前景。