多数致病遗传变异是由碱基点突变、插入或缺失突变引起的，因此，在活细胞中探索修复这些突变的方法，以使细胞恢复正常功能，一直以来都是生命科学领域的一个重要目标。近年来，一种新型的基因编辑工具——引导编辑（Prime Editing, PE）应运而生，这种工具无需双链断裂或供体模板，展现出修正致病突变和插入保护性等位基因的巨大潜力。

随着初代引导编辑效率的提升，David Liu团队对pegRNAs进行了系统性改造，并取得了显著效果。在最新研究中，他们通过优化双AAV载体系统，成功实现了小鼠脑、肝、心等多器官的高效Prime编辑，为未来的基因治疗开辟了新的技术路径。接下来，让我们深入了解v3emPE如何发挥其功能。

v3emPE-AAV双载体系统设计

v3emPE引导编辑系统主要由向导RNA（epegRNAs）和融合蛋白逆转录酶MMLV与nCas9组成，能够对目标位点的碱基进行精准编辑（替换、插入或删除）。v3emPE-AAV系统包含三个关键成分：epegRNAs、逆转录酶MMLV和nCas9，但由于MMLV与nCas9的编码蛋白序列长度（约63kb）超出了AAV载体的包装极限（47kb），因此需要一种创新解决方案。为此，v3emPE与分裂型内含肽（intein）结合，设计成双AAV载体系统，将PE编码序列在nCas9的第1024位氨基酸处拆分，构建在两个AAV载体上。经过共转染后，内含肽将在自剪切作用下重新组装成完整的PE蛋白，恢复其编辑功能。

v3emPE-AAV双载体系统的改进

在v3emPE-AAV双载体系统中进行了几项重要优化：

• 启动子升级：采用强启动子Cbh替代传统的EFS启动子，显著提升PE蛋白的表达水平。
• epegRNA稳定化：通过在traditional pegRNA的3'端添加tevopreQ1修饰及8nt linker，大幅提高了pegRNA的稳定性、编辑效率和特异性，与传统pegRNA相比，优化后的epegRNA的编辑效率提升了15至40倍。
• 编辑策略：使用高保真度的引导RNA（epegRNA）和单导向nicking sgRNA（sgRNA）引导PE到目标DNA位点，设计距离编辑位点40-90nt的nicking sgRNA。

v3emPE-AAV双载体系统的应用

PCSK9Q152H是一种被认为“天然保护突变”的突变，它能显著降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，从而减少冠状动脉疾病的风险且不产生明显的不良反应。文献中使用v3emPE-AAV双载体系统，在成年小鼠的肝脏中成功实现了31%和38%的精准编辑。经过处理的小鼠与对照组相比，总血浆胆固醇降低了20%，血浆LDL胆固醇水平降低了27%，证明了优化后的v3emPE-AAV系统能够在体内实现有效且具有治疗相关性的原位编辑。

v3emPE3-AAV系统的生物安全性

v3emPE3-AAV系统显示出良好的生物安全性：通过CIRCLE-seq技术评估的10个潜在脱靶位点未发现显著脱靶编辑，这证明了Prime编辑的高特异性。毒性评估方面，血清转氨酶（ALT、AST）水平与肝组织病理切片均未发现明显异常，显示出v3emPE-AAV系统不存在显著肝毒性。

作为下一代精确基因编辑方法，Prime Editor展现了其独特的创新能力。南宫28品牌能够根据客户需求，设计个性化的epegRNA和nicking sgRNA，实现特定目标基因的精准编辑。欢迎广大客户前来咨询！